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超敏ECL发光液
所属分类:western实验应用试剂相关产品

产品型号:飞克级超敏ECL发光液

产品介绍
 超敏ECL发光液使用说明书

(初次使用本产品请仔细阅读本说明书)

    western实验中,检测灵敏度是很重要的参数,而发光底物的发光效率很大程度的决定了western检测灵敏度,培清科技开发的此超敏ECL发光液,作为HRP的底物,其发光效率高于Pierce SuperSignal West Dura的发光液16倍。可检测最低值15飞克抗原。并且其本底发光远低于Pierce SuperSignal West DuraMillipore immobilon ECL,本发光液支持长时间曝光。另外,本产品稳定性高支持室温存放。包装规格:A 25ml B 25ml 4或室温保存,室温一年,4℃两年有效。

使用说明:
1.
超敏ECL发光液工作液的配制:等体积混合适量A液和B液,室温放置备用。工作液宜在临检测前配制。
2. Western
二抗孵育后,并进行数次洗涤后,用平头镊将膜取出,然后置于一洁净保鲜膜或本公司配赠的曝光夹膜上。
3.
根据膜的大小,按每10平方厘米膜加0.5ml 工作液,滴加工作液到膜上,确保使工作液均匀覆盖在膜上。
4.
取膜,弃工作液,将膜放在两片保鲜膜中间或本公司配赠的曝光夹膜内,随后进行压片检测或化学发光成像仪检测。
5.
压片检测:将膜固定于片夹内。暗室内压片10-10分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接取3X光片叠加在一起进行曝光,然后一起显影定影观察结果。
6.
荧光成像仪检测:将膜放置到化学发光成像仪内,参考仪器说明书进行检测。

注意事项:

1 A液和B液在吸取过程中必须要更换枪头,A液和B液相互污染后会导致A液或B液逐渐失效,影响后续的使用效果。

2 部分塑料材料或染料具有荧光淬灭的副作用,保鲜膜为食品级PP材料,不产生荧光淬灭的效应,但保鲜膜太柔软易褶皱,操作麻烦,并易造成背景因褶皱产生的不均匀,推荐客户使用曝光夹膜进行western曝光操作,此膜双层硬质高透光(透光率高于97%),荧光不淬灭,不会褶皱,信号更均匀,操作简单。

3 由于本发光液灵敏度高,一抗和二抗浓度大时易造成高背景,推荐使用培清科技低背景封闭及抗体增敏稀释液,可有效降低背景。二抗浓度直接决定背景深度,羊抗兔羊抗鼠HRP二抗,若使用培清科技的产品,统一1:100001:5000,其他品牌二抗须由客户测试后确定。若客户需要将膜上抗体剥离掉进行其他抗原检测,此时务必使用培清科技开发的膜上抗体高效剥离液,其他品牌的剥离液经培清科技内部检测,基本都不可以去除膜上残余信号,并且大多伤害膜上抗原。

附:一,不同品牌发光液发光时间及灵敏性测试:

将本公司羊抗兔二抗(0.5mg/ml)PBS稀释20000倍后,4倍倍比稀释9次,各取1.5ul点于NC膜上(PALL,0.22um),室温放置10min后,加入不同品牌发光底物,其中1为培清科技本产品,2millipore immobilon ECL,3pierce SuperSignal West Dura, 4pierce ECL底物。通过即刻曝光10秒和50秒来比较不同发光液灵敏性,之后将此含有发光底物的膜静置50分钟后再次检测,以比较不同发光液的发光持续时间,检测设备为制冷CCD化学发光成像仪(2x2像素合并)。

结果表明,培清科技超敏发光液检测灵敏度远高于其他国际著名品牌(其中高于pierce ECL 16倍),并且支持长时间曝光,而millipore immobilon ECLpierce ECL会随时间快速衰减,pierce SuperSignal West Dura也可比较持久发光,但灵敏度低于培清科技本产品4倍。

欢迎广大客户一起重复此简单实验,不仅可掌控本实验室发光液质量,也可质控二抗质量。

二,不同发光液本底发光情况测试

剪去4小片NC膜(pall 0.22um),在其上直接滴加上述实验所用的四种发光液,发光液对应编号1,2,3,4也与上述实验一致,先利用外部反射光源对4NC膜进行拍照,记录位置,再关掉外部光源利用制冷CCD拍照5分钟,获得以下结果。

结果表明,培清科技超敏发光液(对应1号)发光本底远低于其他著名品牌(对应2,3,4号),可以推论,之前客户使用进口的灵敏度比较高的发光液,很容易产生整张膜高背景,如果排除封闭液质量不高,洗膜不彻底这两大因素,发光液本底高背景为一个原因。客户解决高背景的手段是稀释一二抗,但这是以牺牲检测灵敏度为代价的。

 三,封闭液,漂洗液,发光液影响western背景的多因素测试

我们设计了客户可方便重复的简单实验,选取4NC膜(pall 0.22um),分别用5%光明牌脱脂奶粉TBST溶液封闭(下图左侧两膜)和自主开发的western低背景封闭及增敏稀释液进行封闭(下图右侧两膜),室温封闭30分钟后,直接加入HRP标记二抗(1:5000稀释),室温孵育1h,之后分别用传统的TBST缓冲液洗膜(下图上方两膜)和改进的TBST洗膜液洗膜(下图下侧两膜),漂洗两次,每次10分钟。之后加入millipore immobilon ECL进行曝光,曝光时间4.5min,曝光后4张膜用PBS快速漂洗两次,加入本超敏发光液,进行曝光,曝光30sec,从而获得以下结果。另外本实验中的传统TBST5%奶粉溶液为新配置试剂,低背景封闭液(货号F00)及改进后的TBST缓冲液(货号F05)按说明书提示为室温长效保存试剂,故选取室温放置7个月并在非无菌环境下反复打开操作过的试剂。

结果表明,奶粉溶液封闭30min,配合使用两种灵敏度较高的发光液,将产生很强的背景信号,而低背景封闭液则可通过较短时间封闭高效降低背景,改进后的TBST缓冲液可在一定程度进一步降低背景。超敏发光液可在更短的时间内获得其他发光液长时间曝光才能获得的信号强度。

 

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